作者通过前期实验确定了化合物1D228可作为新的c-Met和TRK抑制剂候选药物。通过体外模型实验发现，1D228对癌细胞增殖和迁移的抑制作用明显优于阳性药物Tepotinib，可显著抑制体内c-Met和TRK原癌基因（TRKB）双表达肿瘤的肿瘤生长。此外，作者还发现1D228可以抑制癌细胞和内皮细胞，从而提高肿瘤抑制作用。在体内实验胃癌（MKN45细胞系）和肝癌（MHCC97H细胞系）肿瘤模型中，1D228都表现出显著的肿瘤抑制作用（图1A）。重要的是，与阳性药物Tepotinib治疗相比，在MHCC97H和MKN45异种移植肿瘤模型中1D228治疗显示出更强的抗肿瘤活性和更低的毒性（图1B-E）。

图1|1D228的抗肿瘤作用

(图源：An B., et al., Cell Death Dis., 2023)

接下来，为了进一步阐明该抑制剂的作用机制，作者使用转录组测序技术对1D228处理的MKN45细胞中的基因表达进行了分析。结果显示，1D228处理后347个基因下调，573个基因上调，NTRK2、MYC、CEACAM18、AKR1B10、PTPRB、METTL7等多种致癌基因表达减少（图2A）。通过KEGG富集分析发现，1D228可诱导细胞周期、细胞凋亡和NF-KappaB信号通路的改变（图2B-D）。此外，已有研究证明c-Met和NTRK受体协同促进肿瘤进展。根据该研究venn图的结果（图2E-F）显示c-Met和NTRK在多种癌症中同时存在显著异常表达，其中TCGA和GTEx数据库中的21种癌症均表现出异常表达（图2F）。上述结果表明，1D228可能作为c-Met和TRK的双靶点药物发挥抗肿瘤作用。

图2|受1D228调控的基因和通路

(图源：An B., et al., Cell Death Dis., 2023)

转录组结果显示1D228下调多种致癌基因，为了进一步验证1D228是否也作用于其他靶标，作者使用HTRF激酶测定法分析了化合物1D228在500 nM浓度下对77种TK激酶的抑制率（图3A）。结果表明1D228不仅对c-Met激酶具有良好的抑制活性，而且对神经营养因子受体激酶（NTRK）也有一定的抑制活性，其对TRKA、TRKB和TRKC的IC50值如图3B所示。接下来作者利用TRK晶体结构来探索TRK激酶与配体对接的可能模式，发现与TRKA相比，1D228对TRKB和TRKC的良好抑制活性可能归因于这些分子的相互作用(图3C)。同时作者检测了TRK mRNA的表达，发现TRKB基因是MKN45细胞中唯一高表达的基因，内皮细胞中TRKA和TRKB都升高(图3D)。随后，该研究又对肿瘤细胞中的TRKB信号通路进行了研究。Western blot分析显示，1D228的使用导致MKN45细胞中TRKB通路磷酸化蛋白和下游蛋白减少(图3E)。然后以Tepotinib为参考，评估了1D228处理后MKN45细胞中AXL、P-AXL、ALK、P-ALK、MER和P-MER蛋白的表达水平，发现1D228在同时抑制P-AXL、P-ALK和P-MER表达方面表现出明显优于Tepotinib的疗效，为了进一步研究这一点，作者通过使用c-Met抑制剂Tepotinib来抑制c-Met，从而检测了TRKB的活性。结果显示Tepotinib降低了TRKB磷酸化，表明TRKB的激活可能依赖于c-Met活性（图3I）。总的来说，这些发现提供了充分的证据，证明1D228作为一种多靶点激酶抑制剂发挥作用，有效阻断TRK和c-Met信号通路。这种同时抑制可能是在先前体内模型中观察到的抗肿瘤功效的原因。此外，还通过免疫组化（IHC）实验观察到NTRK和c-Met在胃癌组织中共表达（图3J）。综上所述，1D228是c-Met和NTRK的双靶点抑制剂，可能有益于多种癌症患者，如胃癌、胰腺癌和肝癌。

图3|1D228抑制内皮细胞和肿瘤细胞中的受体激酶

(图源：An B., et al., Cell Death Dis., 2023)

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